Protocole d’ Investigation Scientifique

ETUDES SCIENTIFIQUES REALISÉS AVEC GREEN SAP

PROTOCOLE DU TRAVAIL

Essais cinétiques de prolifération cellulaire
Ces essais seront réalisés sur deux types cellulaires:

1. Cellules tumorales: Ligne tumoral lymphoïde d’ origine mourine BW 5147 qu’ expresse l’ haplotype H-2k, CD3+ et le TCRaß, lesquels sont testés de routine par cytometrie de flux utilisant anticorps spécifiques contre les correspondants marqueurs de surface.
2. Lymphocytes T normales provenant de ganglions lymphatiques de ratons decèpe BALG/c de 3-4 mois d’age, obtenus en forme aseptique.

Les essais in vitro seront réalisés en conditions de stérilité en microplaques de culture de 96 wells en un volume final de 0.2 ml.
L’effet sur la prolifération cellulaire de la mélange a essayer sera évaluée á temps différentes de culture (24, 48, 72 y 96 hs.) et en absence (Control) ou présence de différentes concentrations de mélange á fin de déterminer la cinétique d’action du produit. Les concentrations á essayer seront dilutions sériées au moyenne dans un range des concentrations qu’ incluent la dose proposée par usage en humaines (á partir de 1/250 jusqu’au 1/4000).
La prolifération cellulaire sera évaluée a travers de la technique d’incorporation de Timidine tritié (20 Ci/mmol). Pour ça , les cultives cellulaires seront pulsés pour un période de 16 hs dans le cas des lymphocytes normales et de 6 hs pour les cellules tumorales avec Timidina tritié, a prés ça les nucleus cellulaires sont retenus par filtration de papier de fibre de verre, Whatmann GF/A. La Timidine radioactive incorporée au ADN sera quantifié avec compteur de étincelle liquide Wallac.

La concentration de cellules á utiliser sera: pour la ligne tumoral de 3x105 cellules/ml (concentration cellulaire optime final) et pour les cellules normales 2x106 cellules/ml. Tous les deux types cellulaires seront cultivés en medio RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum foetal bovine y 2mM de glutamine et en présence des antibiotiques penicillium (100 U/ml) et streptomycine (100 µg/ml).